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virus-free tissue culture technique
魏宁生
用组织培养技术 ，从带毒植物的茎尖 、芽等组织获得无毒再生植株的方法 。在脱毒过程中主要选用茎尖 、芽等生长点作为外植体（explant） ，故又称为茎尖脱毒（virus-free meristem culture） 。组培脱毒是在组培培养学和病毒学相结合的基础上发展的技术。
简史
1922年美国罗宾斯（J.A.Robins）等用豌豆、玉米和棉花根尖进行组织培养首次获得完整植株 。1943年美国怀特（P.R.White）发现在感染烟草花叶病毒植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒 。1952年摩瑞尔（G.M.Morel）等用感病的大丽菊茎尖分生组织 ，第一次培养得到脱毒的大丽菊 ，标志着组培脱毒研究工作的开始。以后相继进行了马铃薯 、菊花 、兰花、百合 、草莓 、矮牵牛、鸢尾等茎尖脱毒的研究，并获得成功 。中国最早的组培工作是李继侗等1933年用银杏胚培养成植株 。其后，罗宗洛、崔澂 、罗士韦等在玉米 、烟草等作物上进行了幼胚、根尖和茎尖组织的培养。吉林农业大学等单位率先开展了茎尖脱毒工作 ，1976年中科院等单位用茎尖脱毒技术获得了无毒马铃薯。目前已得到了菊花 、大蒜 、百合、石竹等植物的无毒植株（种球） 。利用茎尖脱毒技术获得无毒种球（苗） ，已成为防治病毒病的一项有效途径 。
组培脱毒法和程序
即茎尖脱毒法。主要是茎尖的选取和消毒 、培养基制备等 。
茎尖的选取和消毒
一般选用茎尖和芽，若为休眠鳞茎 、球茎需先进行低温处理待发芽后再取材 。材料用75%酒精表面消毒 ，再用0.1%升汞溶液消毒 ，经无菌水冲洗2～3次置于解剖镜下切取茎尖0.1～1.0毫米的切段，移植到愈伤组织培养基上培养 ，所有操作均在无菌条件下进行。
培养基的制备
用于组织培养的培养基有30种以上 ，但都是在费佛培养基的基本配方上加以改进，并加入一些活性物质发展而来的 。目前应用的大多数培养基是为培养愈伤组织设计的 ，所以对茎尖培养并不完全适合 。摩瑞尔农事培养基等适用于生长点培养 ，其主要成分为硝酸钙（Ca（NO3）2）、硝酸钾（KNO3） 、硫酸镁（MgSO4） 、硫酸亚铁（FeSO4）、肌醇 、生物素等，可用于大丽菊 、菊花、百合等茎尖脱毒培养。大量的研究结果表明：培养基附加2 ，4-D、激动素（KT）可有效地使许多外植体产生愈伤组织；当提供1毫克/升激动素（KT）和0.3毫克/升吲哚乙酸（IAA）时 ，能用于草本植物的茎尖培养，建立脱毒植株繁殖系 。一般激动素/生长素的比例大，有利于芽的发生；生长素/激动素比例大 ，则有利于根的发生 。
组培的条件
要求光照强度在1500～2000勒克斯 ，每日光照10～12小时，温度为22～25℃。
脱毒效果的鉴定
主要有鉴定植物法和抗血清鉴定法 。
植物鉴定法
利用病毒在指示植物上产生的特有症状来鉴定病毒 ，一般采用枯斑反应寄主 。
抗血清鉴定法
常用的是琼脂双扩散法和免疫电镜法。琼脂双扩散法测定过程是先将热溶的精制琼脂溶液倒入培养皿中 ，待冷却形成一层凝胶后在胶上打孔，孔的直径为0.3～0.4厘米 ，两孔间距约0.5厘米 ，然后将样品（抗原）和抗血清（抗体）加入不同位置的孔中进行扩散，观察有无沉淀带。免疫电镜法根据抗体和抗原在铜网上的结合方式又分为两类：聚焦法是在铜网上先加抗血清 ，固定1小时后再加待测样品 ，用磷酸缓冲液冲洗并负染待干燥后观察 。修饰法是先加病毒样品，再加抗体 ，负染观察 。另一种血清检验方法是斑点免疫结合测定法 ，此法是对酶联免疫吸附法（ELISA）的改进，使之更为方便 、实用。具体方法是用华特曼1号滤纸打成直径为7毫米的圆片来代替微量固定反应板，将测样分次滴在小片上并使之干燥后 ，放入直径为10～15毫米的圆筒状小瓶中加入抗血清 ，在旋转振荡器上摇动0.5～1小时 。然后用TBS洗涤 。再加入A蛋白—过氧化物酶于小瓶中，连同纸片一块摇动15～30分钟 ，再洗涤。最后加入底物——氯萘酚并摇动10分钟即可 。如果是正反应 ，在滤纸片中央呈现深蓝色，负反应仅呈现均匀的淡蓝色 。
经鉴定获得无毒植株后需要复壮培养和快速繁殖再进入推广应用。在生产环节中应尽量避免病毒的再度感染 ，有个别植株感病时应及时拔除 。
玫瑰组织培养的方法
2.1外植体选取从生长在田间或盆栽的优良品种植株上 ，选取生长健壮 、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎 。取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎 ，表面污染较为严重 ，难于消毒 。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄 、根 、茎、原生质体 、胚 、花药、子房 、花萼和花托做外植体[7] 。
2.2消毒灭菌及无菌苗的建立取玫瑰外植体 ，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～02%的HgCl浸泡5～15min。用无菌水清洗7～10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒 。消毒灭菌完毕后 ，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中[6] 。
2.3愈伤组织的诱导Hill(1967)最早报道从杂交茶香月季(hybridtearose)的茎上诱导了愈伤组织，该实验证明在培养基中添加2 ，4-D或添加NAA和激动素KT均能很快诱导出愈伤组织。随后不同实验以不同品种为试验材料 ，从叶 、叶柄、根 、茎 、原生质体、合子胚、花药 、子房 、花瓣、花萼 、和花托成功地诱导了愈伤组织 。[7]
2.3.1愈伤组织的成功诱导与品种的基因型有关?摇Lloyd等(1988)曾研究Roseprsica与xanthina，hybrida ，Clarissa ，Rcabrosa的愈伤发生能力，发现只有Rosepersica与xanthina在MS基本培养基上 ，添加低浓度的BAP和NAA时 ，节间能产生愈伤，愈伤组织脆弱 ，呈淡黄绿色 。Kunitake等(1993)研究了RoserugosaThunb ，Rosemultiflora，Roseallbacv ，SemiplenaRosehybridacv ，DuplesRoseharisonii，Rosespinosissi的未成熟种子的愈伤发生能力，发现只有RoserugosaThurb能产生愈伤组织 ，品种Rontl和Soraya比品种Baccara和Mercedes更易产生愈伤(Kintzios等 ，1999)。[7]
2.3.2外植体类型?摇Aren等(1993)详细地调查了RosehybridacvMeirutral不同外植体的愈伤诱导率，发现不同外植体愈伤产生的能力不同 ，叶为90% ，根为70%，节间为55% ，花药为19% 。
2.3.3激素激素也是影响愈伤生成的重要因素 ，Rout等(1991)以Landora为材料，在添加BA和NAA ，2 ，4-D的MS的培养基上，外植体在接种的7～12d后 ，在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤 ，愈伤组织诱导频率高达92% 。在接种后15～20d，外植体茎切端处产生愈伤，诱导率为76%。生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大 。早期实验多采用NAA结合BAP或BA等 ，近年来多采用2 ，4—D，并证明2 ，4—D是诱导愈伤的必要因素(Kintzios等 ，1999;Rout等，1996;vanderSalm等 ，1996;Vises—suwan等 ，1997) 。进一步研究发现2，4-D对愈伤的诱导效果依赖于月季的基因型 ，如2 ，4—D浓度从113umol/L增加到181umol/L降低了Rosehybrida栽培种“Care-freeBeauty ”的愈伤诱导频率，但该浓度则对另一个品种“GrandGala ”无影响。对于“RedSunblaze”而言 ，当浓度从113umol/L增加到452umol/L ，则表现出愈伤的诱导率提高了，随后当2，4—D再增加 ，则显著地降低愈伤的诱导频率 。愈伤组织在诱导愈伤组织的培养基上能得到很好继代培养(subculture 、Li等 ，2002) 。VanderSalm等(1996)证明2，4—D对诱导Rosepersica与xanthina和Moneyway产生愈伤是非常必要的 ，进一步添加低浓度的BA有正效应 ，但如BA浓度过高，则产生抑制作用。与以上实验结果不同 ，Kintzios等(1999)则发现2 ，4—D对愈伤诱导有负影响作用，可能因为采用的外植体是成熟的叶片。
2.3.4合子胚的发育时期对愈伤的形成能力也有影响?摇如处于心形胚的合子胚 ，其愈伤诱导率只有2% ，子叶胚时的合子胚愈伤诱导率达到85% 。[7]
2.4不定芽的诱导月季的常规繁殖方式主要靠扦插、嫁接和压条等，繁殖系数低 ，远远满足不了生产的需要 。80年代初 ，采取组织培养方法快速繁殖月季苗，用侧芽 、顶芽 、并诱导生根。第一报道月季不定芽形成见Elliott(1970)，他在聚花月季(Rosemultiflora)上成功地诱导了不定芽的形成 ，并诱导幼苗生根 。Zieslin和Halevy(1976)报道细胞分裂素有利于提高不定芽的数量 ，但也诱导花器官败育或退化的频率 。不定芽的诱导与供试材料的基因型有关，同时还与外植体的取材部位有关 ，来源于枝条中部的侧芽的繁殖速率最快(Bressan等 ，1982)。培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用(Langford和wainwright，1987);加入低浓度的GA能进一步改善芽繁殖 ，95%的外植体能产生7个以上的不定芽(Rout等1990) 。能提高芽繁殖数量的物质还有月桂酸甲酯(Voyiatzi等 ，1995)、乙烯(Kevers等，1992)等 。诱导不定芽的培养基为MS培养基添加低浓度的激素BAP03～05mg/L ，NAA0004～03mg/L或IAA或GA00～20mg/L。[7]Martin等(1981)调查了2125个玫瑰侧芽做外植体获得的无菌苗三年间在大田生长的情况 ，没有发现变异植株，这说明侧芽方式繁殖的玫瑰植株性状很稳定 。
2.5增殖培养玫瑰的增殖培养 ，一靠无菌苗切段繁殖 ，二靠诱导不定芽，形成从生苗;三靠愈伤组织形成体细胞胚或原球胚 。将已长大的月季嫩茎切成带1～2个节的茎段，投入新鲜的增殖培养基上 ，5～6周进行一次继代增殖 ，增殖系数平均达4～6。在外植到培养10～15d内第一叶的叶原基伸长，第二叶片叶原基可见;15～20d侧芽伸长;25～30d长度达6～10mm ，继代增殖会按几何级数增长起来 。[5]增殖培养基可用不定芽诱导培养基 ，如MS+BA03～05+NAA0004～03mg/L 。
2.6壮苗与生根壮苗培养的培养基为：MS+BA03～05+NAA001～01或MS+BA03～05+IBA03。[4]也可以壮苗为主，增殖为辅 ，使增殖与壮苗合二为一。玫瑰组培苗增殖与壮苗需光照10～12h ，光照强度2000lx，温度24～26℃ 。[4]
玫瑰在组培过程中 ，其生根能力因品种特性 、所用植物材料及培养基成分而有较大差异 ，许多研究结果表明，玫瑰茎段微繁殖容易生根 ，使用植物激素IAA ，IBA或NAA含量01～05mg/L，蔗糖含量2%～25%的MS培养基有利于玫瑰茎段生根 。另外，光照 、温度等对玫瑰微繁殖生根也有直接影响 ，Bressan等(1982)研究指出 ，光照时间每天12h以上，光照强度适宜则有利于生根。一般情况下 ，玫瑰茎段组织培养8～10d内则可生根 。[6]加入适量的活性炭有利于玫瑰生根 。
2.7炼苗与大田移栽炼苗和大田移植是玫瑰微繁殖获得成功的最后阶段。[6]组培幼苗由人为培养环境转移到天然生长环境中 ，环境条件发生巨大变化，湿度大幅度降低 ，温度不恒定 ，光照强烈，微生物多 ，故需炼苗过渡 。一般玫瑰微繁殖炼苗需经过室内三天的取盖炼苗 ，然后将苗从瓶中取出，洗去根部培养基 ，定植在珍珠岩、泥炭 、蛭石或沙土中 ，用3～5%的多菌灵喷洗 。炼苗时要注意基质中的水分含量，水分太少，不能满足苗生长发育;水分太多 ，导致烂苗。炼苗中 、后期要注意通气 ，给予足够的光照，其幼苗成活率可达80%以上 。
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